Epifluorescent熒光單分子計數 鏈霉親和素標記藻紅蛋白【煙臺科瑞斯】上一、介紹自光學顯微鏡發明以來，研究人員一直在努力提高目標信號相對于背景噪聲的影響。熒光團因其亮度、明確的激發和發射、重復性和在生物系統中的易用性而成為主流的信號產生標記物。然而，使用熒光團也引入了一定的局限性。由于光子的基本物理特性，衍射極限以下的特征無法分辨。此外，單一甚至成簇的熒光團在背景下很難用傳統的熒光顯微鏡分辨出來。因此，衍射和背景信號是單分子熒光檢測的主要依據。成功克服光的衍射極限的各種方法統稱為超分辨顯微鏡。在過去的幾十年里，隨著儀器、光學、熒光團化學（自發熒光染料）和成像后計算處理的變革性進步，超分辨顯微鏡得到了深刻的改進。熒光團信噪比的改善主要依賴于的成像裝置，如全內反射熒光(TIRF)顯微鏡，其中產生的消逝波僅在界面附近激發熒光團或共焦顯微鏡，利用針孔來阻擋來自探測器的失焦光。而在過去的幾十年里，研究實驗室不得不手工構建單分子檢測系統越來越多的商業統包解決方案。盡管取得了這些進展，但許多研究實驗室無法獲得專門的單分子設備。熒光顯微鏡是細胞生物學和免疫熒光成像的主要設備。由于超熒光顯微鏡在信號分辨方面還沒有得到優化，因此要分辨單個分子，就需要一種明亮的熒光共軛物。二、實驗結果1.玻璃表面熒光測量作者測試了SA-PE偶聯物是否可以在“類似TIRF”的表面檢測試驗中發揮作用，其中熒光分子將定位到玻璃界面并成像。TIRF顯微鏡通過只照亮靠近光界面的薄樣品層來降低背景強度。相比之下，表觀熒光顯微鏡從整個樣品中收集光，遮蔽了單個的熒光團。因此，當使用表觀熒光顯微鏡時，需要一個明亮的熒光共軛物來提高信號在背景之上。首先，在玻璃表面鈍化前將生物素化牛血清蛋白(BSA-bt)沉積在玻璃上。然后我們分別添加SA-PE共軛物來檢測固定化BSA（圖 1a）。能夠在玻璃表面分解單個SA-PE共軛物(圖1B)。得出結論， 這些SA-PE偶聯物成功地提供了可分辨的單分子信號。 為了測試是否能列舉出玻璃表面上的一種分析物的已知數量，作者準備了一種單分子計數試驗(圖2A)。選擇了熒光雖然不像其他共軛物那么亮，但低背景表面結合的SA-PE（PJRS27）(圖S2A和B)。鏈霉親和素在96孔板中孵育，以非特異性地粘附在表面。使用的生物素化小鼠單抗體(mAb-bt)作為分析物。mAb-bt在起始濃度為500 pM和經過兩倍連續稀釋至7.8 pM時進行測量(圖2B)。觀察到病灶數目與mAb-Bt分析物濃度之間的線性相關關系（圖 2c）。有限的非特異性背景結合使SA-PE結合物的靈敏度20pm，證明SA-PE可以用于表面分析物的檢測和定量。2.單分子診斷學首先在一個檢測相同生物素化抗體（mAb-Bt）的模型試驗中測 試熒光信號 圖 2 (圖 3a）。用山羊抗鼠抗體包被磁性微粒，并用一系 列飛摩濃度的mAb-Bt包裹磁性微粒。微球洗滌，與SA-PE結合物孵育， 再次洗滌，轉移到玻璃底板上成像。我們在微粒上清楚地看到了單獨的SA-PE結合（圖 3b）。同樣，亮的三個SA-PE共軛物--PJRS20、 PJRS34和PJRS301--產生了高的信號（圖 3C、圖 S3)。中等亮度的共軛物PJRS25和PJRS27，在微粒上都是可見的，但暗淡的PJ39S幾乎無 法分辨（圖S3)。6種SA-PE偶聯物中的4種與識別的靶點和mAb-bt濃度呈線性相關，PJ39S和PJRS27都太暗淡，無法量化。亮的三種SA-PE偶聯物之間的差異不影響該方法的檢測靈敏度，所有方法的低端靈敏度極限均為~15 fM(圖3C，圖S3)。因此，我們表明SA-PE共軛物可以用于模型診斷試驗中的基于數字的檢測。初篩選的亮的三種SA-PE共軛物，用于與微粒的非特異性結合。PJRS20表現出顯著的非特異性結合，而PJRS301表現出更好的性能，被選擇用于分析物檢測(圖S4)。再一次，我們清楚地能夠解決微粒上的單個病灶，這些微粒對HBsAg的稀釋有劑量反應（圖 4b）該數字分析法顯示HBsAg的靈敏度極限為4.1 mIU mL?1，與商業化學發光法相比，靈敏度提高了約5倍(圖4C)。因此，表明商用SA-PE共軛物可用于臨床相關分析物的敏感檢測。【聯系方式】座機：手機：117地址：山東省煙臺市高新區科技大道39號郵箱：網站：www.crystalbiosystems.com